角膜缘干细胞的量子点标记及体外移植示踪

体外培养的人角膜缘上皮细胞（Human Limbal Epithelial Cells, HLEC）在治疗角膜缘干细胞缺陷性疾病方面显示良好的应用前景。但是，对于其移植后的存活状态、行为方式以及长期效应等尚不明确。伦敦大学眼科研究所及莫菲尔眼科医院Alex J. Shortt课题组，应用量子点技术作为HLEC体外移植的示踪工具，并对其行为和有效性进行了评价。

Nuria Genicio等体外分离培养HLEC细胞，以偶联穿膜肽的量子点标记细胞，通过细胞活力分析实验确定，量子点标记没有产生细胞毒性；克隆形成实验显示，量子点标记对于细胞增殖没有明显影响；对于干细胞及其分化标记物CK3、p63以及ABCG2等的表达分析显示，量子点标记不影响HLEC的分化。接下来，利用器官培养模型形成去细胞的角巩膜缘，然后将体外培养并标记量子点的HLEC细胞培养层移植入角巩膜缘（图1），在之后的示踪观察中，虽然细胞增殖导致量子点荧光信号逐渐减少，但是仍足以示踪多次传代的细胞，应用激光共聚焦显微镜可持续观察至少2周（图2）。上述实验对于临床干细胞治疗提供了基础实验数据，同时尚需应用在体模型进行深入分析与评价。

图1 以量子点（红色）标记HLEC细胞培养层并移植入器官培养模型。

（A）标记量子点（红色）的HLEC细胞培养层于荧光显微镜下成像；（B）通过蛋白酶消化，量子点标记的HLEC细胞培养层从培养基底脱落；（C）器官培养室中去细胞的人角巩膜缘；（D）HLEC细胞培养层移植后7天，与角巩膜缘重构的激光共聚焦图片。

图2 量子点标记（红色）的HLEC细胞培养层移植入去细胞的角巩膜缘及其示踪。

①    A列及D列提示相邻的图像采集部位；

②    B列及C列显示移植后7天及14天，角膜表面呈现量子点标记的HLEC细胞；

③    E列及F列显示移植后7天及14天，角巩膜缘表面呈现量子点标记的HLEC细胞；

④    移植后7天，完整的上皮层覆盖全部角膜（B）和角膜缘（E），其中大量细胞有量子点标记，提示移植细胞存活超过7天；另外，角膜缘区域（E）比角膜区域（B）呈现更多标记量子点的细胞，同时，角膜缘区域呈现标记明亮量子点的细胞簇集（E），但是在角膜区域（B）没有该现象；

⑤    移植后14天，量子点标记细胞减少，但是仍有完整的上皮层覆盖角膜（C）和角膜缘（F），角膜区域（C）量子点信号的下降较角膜缘（F）更加显著；在角膜缘区域（F），含有明亮量子点的细胞簇集持续至移植后2周，但是不如初始时刻显著。