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Nature communications：基于量子点的多轮次多色原位成像技术
华盛顿大学Gao Xiaohu课题组，利用Protein A与量子点（Quantum dots，QDs）的偶联物，通过Protein A捕捉抗体Fc片段，从而获得QD-Protein A-Ab荧光探针（图1）。该量子点荧光探针制备简单、成本低、适合流水线分析，同时易于洗脱，不会对下一轮染色发生干扰，并保持靶抗原和标本形态在每一轮染色中的完整性。对于每轮的多色共染，需要利用荧光光谱仪进行光谱分离和定量分析，从而获得单个细胞的详细的分子谱定量信息，对于系统生物学、基因表达研究、信号传导通路分析以及分子诊断具有重要意义。
在每轮的多色共染中，可分析N个靶标分子，而N的大小取决于对不同荧光探针的光谱分辨能力。如果每20nm发射波长即有对应的量子点进行抗体标记，同时荧光光谱仪有十个通道进行光谱分离和定量分析，那么，每轮可同时进行十个颜色的共染，如果再经过九个轮次的脱色-再染色，理论上可以在同一张固定样本上实现共计100个（10X10）靶标分子的分析。上述课题组开展了每轮5个颜色共染、反复进行5个轮次的原位成像分析，结果显示，全部五个靶标分子在五轮染色中呈现一致的染色模式和平均染色强度，同时每轮染色后没有荧光信号残留，标本在五轮染色后依然保持了良好的细胞形态（图2）。
图1 QD-Protein A-Ab荧光探针的多轮次多色原位成像模式图
(a) 染色前，QD-Protein A偶联物捕捉溶液中抗体（Ab），形成功能化的QD-Protein A-Ab荧光探针； (b) 将不同的探针汇集形成鸡尾酒混合物；(c) 混合探针与固定细胞孵育，进行平行的多色共染； (d) 利用荧光光谱仪采集图像和光谱数据，形成各抗原的表达谱；(e) 以再生缓冲液进行简短漂洗，使标本完全脱色；(f) 进行下一轮其它靶标的多色共染。
图2 QD-Protein A-Ab荧光探针的25个靶标成像分析
(a-e) 五个轮次的靶标成像：发射波长为525/545/565/585/605nm的QD-Protein A-Ab分别标记Ki-67/HSP90/Lamin A/Cox-4/b-tubulin；
(f) 五轮染色具有一致的平均荧光强度。
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