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量子点活细胞成像应用的实验方案建议
量子点活细胞成像应用的实验方案建议
量子点（Quantum dot, QD）是一种新型荧光纳米材料，又称半导体纳米晶，呈近似球形，三维尺寸在2-10nm，具有明显的量子效应，其物理、光学、电学特性优于传统有机荧光染料，是新一代荧光标记探针的优质选择。
Chan等将量子点与传统有机荧光染料进行了光学特性的比较，发现量子点的荧光亮度是传统荧光染料的20倍、量子点的光稳定性是传统荧光染料的100倍。但是，量子点作为无机合成的纳米材料，其大小、化合价以及细胞内递送等方面也存在一定的局限性。建议研究者根据实验目的和实验设计，综合考虑量子点的光学特性和物理化学特性，选择合适的量子点细胞标记方法。本文综合了量子点在活细胞成像研究中的相关技术，以供研究者参考。
一、量子点与传统荧光染料的比较
1. 荧光亮度：单个量子点比绝大多数单个有机荧光染料的光亮度强，可多出数个数量级（Wu et al, 2003）。
2. 光谱特性：与传统荧光染料完全不同，量子点的激发光谱范围宽泛，在350nm至450nm范围内的紫外光及蓝色光源均可激发量子点发光；同时，量子点的发射光谱非常窄，半峰宽小于30nm，而传统荧光染料的半峰宽达到100nm。量子点上述特性使其适合同一波长的多色激发、而且多色光之间没有相互干扰。
3. 光稳定性及抗代谢降解能力：量子点的光稳定性强于传统荧光染料，可达数个数量级。同时，量子点自身的无机特性，使其具有抗代谢降解的能力，可在机体内稳定存在数周至数月，适合对细胞状态和分布进行体内示踪。
4. 与生物分子的耦联：量子点表面积较大，除了可以耦联靶标分子（蛋白质、多肽、核酸等），还可以耦联治疗药物（如抗肿瘤药物）和检测试剂（如磁珠、放射性同位素等）。因此，量子点在分子示踪、活细胞成像、肿瘤诊断与治疗以及纳米载药等研究领域具有广泛的应用。
5. 大小：量子点作为呈现壳-核结构的纳米材料，其核心的大小一般是3~10nm，其表面需要包被、修饰及水化处理。商品化的量子点一般都大于20nm，该大小的量子点适合在体标记组织（如前哨淋巴结、肿瘤等）或示踪细胞，但是对于标记单个生物分子，则不利于单分子的细胞内迁移和轨迹示踪，需要定制粒径更小的量子点。
6. 化合价：目前商品化的量子点都是以多价偶联方式在其表面结合多个分子，但是，单分子成像与示踪需要进行单分子标记，目前在量子点表面以单价偶联方式进行单分子标记尚未商品化、需要专门定制。
7. 细胞内递送：量子点的大小及无机特性使其难于进入细胞，量子点在细胞内倾向于聚集，不利于细胞内分子成像与示踪的应用。目前，已有相关辅助试剂或应用细胞穿膜肽等技术，从而提高量子点进入细胞的效率、并保持量子点在细胞内的均匀分布。
二、细胞标记方法
量子点可以标记细胞膜表面分子和细胞内分子，其中对细胞膜表面分子的标记更为简单易行。如果研究者的实验目的为示踪细胞或组织，或是研究细胞表面受体，只需将量子点与膜表面分子进行标记；而如果研究者的实验目的是示踪细胞内的分子，在标记之外，尚需考虑量子点标记物的细胞内递送方法。关于细胞标记和细胞内递送的方法总结如下：
1. 细胞表面分子的标记
方法一：量子点与膜表面分子的抗体或配体耦联
①量子点纯化；
②确定靶细胞表面的目标分子，以其抗体或配体与量子点耦联；
③将上述抗体/配体-量子点偶联物，与细胞孵育（建议4℃孵育，以减少细胞对量子点的内吞）。
优点：细胞标记步骤少，只需抗体/配体-量子点耦联物与细胞的一步孵育反应。
缺点：针对不同的抗体或配体，需要摸索不同的量子点耦联方法；同时，某些抗体或配体可能难以进行有效耦联。
方法二：通过链霉亲和素-生物素系统实现量子点对膜表面分子的标记
①链霉亲合素-量子点纯化；
②确定靶细胞表面的目标分子，将其抗体或配体进行生物素化处理；
③将生物素化的抗体或配体，与细胞孵育；
④以培养基或合适的缓冲液清洗细胞，去除过量的生物素化的抗体或配体；
⑤将链霉亲合素-量子点，与细胞孵育（建议4℃孵育，以减少细胞对量子点的内吞）。
优点：对抗体或配体进行生物素化处理简单易行；同时，链霉亲合素-生物素系统具有信号放大作用。
缺点：细胞标记步骤较多，需要两步孵育反应。
2. 细胞内分子的标记
上述标记细胞表面分子的方法，均可用于标记细胞内分子，即：标记形成抗体/配体-量子点偶联物或生物素-链霉亲和素-量子点系统。但是与细胞表面标记不同，对于细胞内分子的标记，尚需考虑量子点偶联物的细胞内递送问题，具体递送方法总结如下，以供研究者参考。
方法一：细胞直接内吞量子点
① 将水溶性量子点与细胞共孵育数小时；
② 以合适的培养基或缓冲液洗去过量的量子点。
对于不同的细胞，其内吞能力不同，需研究者对量子点的用量和孵育时间进行摸索。同时，上述量子点进入细胞后，存在于内吞体中。
方法二：通过阳离子脂质体递送量子点入胞
① 制备并纯化带负电荷的量子点（如表面羧基化修饰的量子点）；
② 在无血清培养基中与脂质体转染试剂（如Lipofectamine2000或FuGENE6）共孵育（详细步骤参见转染试剂说明书）。
该方法在肿瘤细胞中适用良好，但是对于不同的细胞、不同的转染试剂，转染能力和效率可能不同，需研究者对试剂用量和孵育时间进行摸索。
方法三：通过胞饮作用递送量子点入胞
Invitrogen（Life technologies）公司试剂——Influx pinocytic cell-loading reagent（I14402），通过胞饮囊泡的渗透性裂解，将水溶性量子点递送入活细胞。以该方法进入细胞的量子点，在细胞内分布均匀，没有聚集成团的现象、不形成胞内体。该方法周期约30min，可通过重复加载来增强量子点入胞的量，同时可以再生而重复利用。该方法不会对细胞造成物理破坏，比显微注射简单，同时不会改变细胞活力、不会导致细胞内溶酶体酶的释放。详细步骤参见试剂说明书。
方法四：通过穿膜肽协助量子点入胞
细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPP）又称PTDs（Protein Transduction Domains），包含大量碱性氨基酸，主要来源于HIV-1的Tat蛋白，其中多聚精氨酸（Polyarginine）较多聚赖氨酸/组氨酸/鸟氨酸等更高效，最高效的是含octa-arginine或nona-arginine（R9）的多肽。CPP的穿膜作用不依赖于其它分子或耗能途径，几乎没有细胞毒性。CPP可将直径达到200nm的物质递送入细胞，实验研究显示，富含精氨酸的CPPs可向细胞内递送蛋白质、DNA、RNA以及量子点。
CPPs与量子点的连接方式包括共价偶联及非共价偶联，而且CPPs可同时递送共价及非共价偶联物进入细胞。量子点与CPPs的共价偶联，是基于量子点表面的不同活性基团，利用BS、EDC、sulfo-SMCC、NHS-PEO4-MAL等交联试剂形成量子点-CPP偶联物；同时，可以通过生物素-亲和素系统、静电相互作用、金属亲和作用等方法，实现量子点与CPPs的非共价偶联。总之，针对不同的多肽和实验需求，需要研究者进行必要的选择和实验探索，更详细的实验方法请参见相关文献。
方法五：显微注射
玻璃毛细管具有亚微粒级别的尖头，可将量子点于局部直接注入细胞。该方法中，量子点用量很少（1-10pmol），对细胞的生理特性和发育没有明显影响。
如：刮擦加载量子点入胞，崩溃细胞膜直接将量子点载入细胞浆，电穿孔，低渗休克等，详见相关文献。
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